1.首先取出内消毒桶，然后在外锅中加入适量的水，使水与三角架平齐。
2.返回灭菌桶，装入待灭菌物品。注意不要包装太拥挤，以免阻碍蒸汽流动，影响灭菌效果。三角瓶和试管端部不应与筒壁接触，以免冷凝液浸湿口中包裹的纸，渗透棉塞。
3.盖上盖子上的排气软管并将其插入内消毒桶的排气罐中。然后对称同时拧紧两个相对的螺栓，使螺栓均匀拧紧，以免漏气。
4.用电炉或煤气加热，同时打开排气阀，水沸腾，除去锅中的冷空气。冷空气排尽后，关闭排气阀，使锅内温度随蒸汽压力的增加而逐渐升高。当锅内压力上升到所需压力时，控制热源并将压力维持在所需时间。实验在1.05千克/平方厘米，121.3摄氏度下灭菌20分钟。
5.当灭菌时间到了，切断电源或关闭气体，使灭菌锅内的温度自然下降。当压力表压力降至0时，打开排气阀，松开螺栓，打开盖子，取出消毒物品。如果压力不降到0，排气阀打开，壶内压力突然下降，容器内的培养基因内外压不平衡而冲出烧瓶或试管口，导致棉塞污染培养基。
6.将消毒后的培养基放入37℃培养箱中培养24小时。经检验，如无细菌生长，可使用。
